生化分離工程
[拼音]:shenghua fenli gongcheng
[外文]:biochemical separation engineering
生物化學(xué)工程的一個(gè)組成部分。生物化工產(chǎn)品系通過(guò)發(fā)酵過(guò)程、酶反應(yīng)過(guò)程或動(dòng)植物細(xì)胞大量培養(yǎng)獲得。從上述培養(yǎng)液或反應(yīng)液中分離、精制有關(guān)產(chǎn)品的過(guò)程即稱為生化分離工程或稱下游加工過(guò)程(downstream pro-cessing),它由一些化學(xué)工程的單元操作組成, 但由于生物物質(zhì)的特性,有其特殊要求,而且某些單元操作在一般化學(xué)工業(yè)中應(yīng)用較少。
培養(yǎng)液是復(fù)雜的多相系統(tǒng),其中所含欲提取的生物物質(zhì)濃度很低,而雜質(zhì)含量卻很高,特別是基因工程產(chǎn)生的許多新的蛋白質(zhì)常常伴有大量性質(zhì)相似的雜質(zhì)蛋白質(zhì),使分離、精制工作非常困難。同時(shí)在總成本中,下游加工費(fèi)用常占很大比例,在50%~70%之間,因此無(wú)論從技術(shù)、還是從經(jīng)濟(jì)方面,生化分離工程都引起重視。下游加工過(guò)程的一般步驟(見(jiàn)圖)包括提取和精制。
提取
包括培養(yǎng)液(如發(fā)酵液)的預(yù)處理和細(xì)胞的破碎和分離。
培養(yǎng)液的預(yù)處理
培養(yǎng)液預(yù)處理的目的在于改變培養(yǎng)液的性質(zhì),使其便于過(guò)濾和提取。一種有效的方法是加入絮凝劑,使細(xì)胞或溶解的大分子化合物聚結(jié)成較大的顆粒。無(wú)機(jī)絮凝劑有硫酸鋁、氯化鈣、氯化鐵、堿式氯化鋁等。有機(jī)絮凝劑有聚丙烯酰胺、聚丙烯酸鈉、聚季銨酯等中性、陰性和陽(yáng)性的絮凝劑。高聚物的分子量對(duì)絮凝效果有很大影響。由于細(xì)胞表面常帶負(fù)電,因此處理培養(yǎng)液常用陽(yáng)離子絮凝劑,但有時(shí)細(xì)胞表面也可以吸咐陽(yáng)離子變成帶正電的。還可在生物活性物質(zhì)穩(wěn)定性的范圍內(nèi),利用酸化、加熱、加入助濾劑,或把幾種方法結(jié)合起來(lái),能使過(guò)濾速度大大加快。
一種新的過(guò)濾方法,是利用超過(guò)濾膜進(jìn)行錯(cuò)流過(guò)濾,此時(shí)無(wú)濾餅形成,對(duì)細(xì)菌懸浮液,濾速可達(dá) 67~1181/(m2?h)。
細(xì)胞的破碎和分離
細(xì)胞破碎的方法有機(jī)械、生物和化學(xué)等各種方法。大規(guī)模生產(chǎn)中常用高壓勻漿器和珠磨機(jī)。前者利用液相剪切力和與固定表面撞擊所產(chǎn)生的應(yīng)力;后者利用固相剪切力,兩者機(jī)理不同,可相互補(bǔ)充。
細(xì)胞碎片分離通常用離心分離的方法,但非常困難,因?yàn)轭w粒減小,密度差也減小,同時(shí)有高聚物分泌出來(lái),使粘度增加。一種新的辦法是雙水相萃取法。由于高分子聚合物的不相容性,使兩種高聚物的水溶液(含鹽或不含鹽)可以分成兩相甚至多相,例如聚乙二醇與葡聚糖等的水溶液。細(xì)胞顆粒或蛋白質(zhì)分子可在兩相間進(jìn)行分配。影響分配系數(shù)的因素有高聚物的種類(lèi)和濃度、高聚物的分子量、離子的種類(lèi)、離子強(qiáng)度、pH值和溫度等。
精制
生化產(chǎn)品精制的方法常用沉淀、萃取、吸附和離子交換以及超濾等。
沉淀法
溶解的蛋白質(zhì)由于表面電荷或極性基團(tuán)所形成的水化層而達(dá)到穩(wěn)定。加入高濃度的無(wú)機(jī)鹽,如硫酸銨,可使蛋白質(zhì)沉淀。其定量關(guān)系可用科恩方程式表示:lgS=β–kI式中S代表溶解度;I代表離子強(qiáng)度;β和k是常數(shù)。β與溫度、pH值有關(guān),k決定于加入鹽的種類(lèi)。調(diào)節(jié)pH至等電點(diǎn)也可使蛋白質(zhì)沉淀,此時(shí)科恩方程式仍適用,但β在等電點(diǎn)時(shí)有極小值。加入有機(jī)溶劑也可使蛋白質(zhì)沉淀,但會(huì)使蛋白質(zhì)失活,所以應(yīng)在低溫下進(jìn)行。也可加入非離子型聚合物,如聚乙二醇和聚電解質(zhì)(絮凝劑)。分子量為40000~60000的聚乙烯亞胺是常用的沉淀劑。
萃取法
用通常的有機(jī)溶劑萃取法提取酶等蛋白質(zhì)是不合適的,因?yàn)槊溉菀资Щ?。?yīng)用雙水相萃取法可避免這種困難。已成功地應(yīng)?美刺崛〖姿嵫甕亞餉福?α-葡糖苷酶和支鏈淀粉酶等,但此法的最大困難是PEG、葡聚糖等價(jià)格較貴,一些新的萃取方法,如液膜萃取和超臨界流體萃取也正在開(kāi)始研究應(yīng)用于生物工程中。
吸附和離子交換
廣泛用于抗生素和氨基酸提取。
用一般的離子交換樹(shù)脂吸附酶等蛋白質(zhì)是有困難的,因?yàn)槊冈谖?、解吸過(guò)程中易破壞。將樹(shù)脂的骨架由憎水性改為親水性,如由經(jīng)過(guò)加工的纖維素所制得的離子交換劑,則可用來(lái)提取蛋白質(zhì)。
液體離子交換樹(shù)脂多數(shù)是分子量為250~500的胺或有機(jī)酸。使用時(shí),將它溶于一種有機(jī)溶劑中,欲提取的溶質(zhì)就從水溶液選擇性地移向有機(jī)相。例如頭孢菌素 C可以用液體離子交換劑進(jìn)行提取。
超濾法
主要用于胞外酶的濃縮和去除低分子量的雜質(zhì)。在超濾時(shí),隨著溶劑的透過(guò)膜,保留液的體積逐漸減少,粘度逐漸增大,不利于超濾的繼續(xù)進(jìn)行。如果不斷加入水或緩沖液,以保持原來(lái)的體積,就可避免這個(gè)缺點(diǎn)。這種操作稱為透析過(guò)濾法。酶經(jīng)過(guò)超濾后常引起失活,其原因還不十分清楚,可能有下列幾種:
(1)Ca2+、Zn2+ 等低分子的穩(wěn)定劑被除去;
(2)由于流過(guò)薄膜時(shí)的剪切力;
(3)膜的吸附作用。在超濾時(shí),加入可溶于水的聚電解質(zhì),可以使酶穩(wěn)定。
色層分離
隨著重組DNA技術(shù)的發(fā)展,新的蛋白質(zhì)不斷出現(xiàn),純化這種蛋白質(zhì)對(duì)色層分離技術(shù)提出更高的要求。用于分離無(wú)機(jī)離子和低分子量有機(jī)物質(zhì)的色層分離介質(zhì)已不能適用。用于分離蛋白質(zhì)的介質(zhì)的母體必須有足夠的親水性,以保證有較高的收率,同時(shí)應(yīng)有足夠的多孔性,以使大分子能透過(guò),和足夠的強(qiáng)度,以便能在大規(guī)模柱中應(yīng)用。此外還應(yīng)有良好的化學(xué)穩(wěn)定性和能引入各種官能團(tuán),如離子交換基團(tuán)、憎水烴鏈、特殊的生物配位體或抗體等,以適應(yīng)不同技術(shù)的要求。工業(yè)上適用的母體有天然、半合成或合成的高聚物,如纖維素、葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺等。親水凝膠的一個(gè)固有缺點(diǎn)是強(qiáng)度不夠,當(dāng)放入柱中使用時(shí),會(huì)發(fā)生變形,使壓力降增大或流速減小。這個(gè)困難可通過(guò)改進(jìn)柱的設(shè)計(jì)來(lái)補(bǔ)救。要增大分離能力,可以增大柱徑而不是柱高。分級(jí)柱可使壓力降在流速高時(shí)限制在某一水平。采用均勻、球形的分離介質(zhì)可使壓力降減小。強(qiáng)度較好的分離介質(zhì)和層析柱設(shè)計(jì)的化工問(wèn)題的解決是色層分離法工業(yè)化的關(guān)鍵。聯(lián)邦德國(guó)生產(chǎn)的1501不銹鋼分格柱和瑞典生產(chǎn)的KS370分段色層柱(每段容量161,可根據(jù)需要增加或減少段數(shù)),都已用于工業(yè)。
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